造血干细胞（hematopoietic stem cell, HSC）维持整个造血系统的细胞群体组成与功能。内皮-造血转化（endothelial-to-hematopoietic transition, EHT）是HSC重要的起源过程：在背主动脉的腹侧，部分早期动脉内皮细胞（early arterial endothelial cell, eAEC）特化为生血内皮细胞（hemogenic endothelial cells, HEC），产生造血干细胞前体（pre-HSC），进而成熟发育为长期造血干细胞（long-term hematopoietic stem cell, LT-HSC）。虽然单细胞转录组分析及功能实验验证剖析了从eAEC向HSC发育的动态轨迹上的不同细胞群体1, 2，但是，HSC谱系起源和命运决定是如何受到包括染色质三维结构、组蛋白修饰及转录因子的多维表观机制整合调控的，则尚未可知。
2022年1月17日，北京大学未来技术学院分子医学研究所、北大-清华生命科学联合中心何爱彬研究组在 Nature Communications 杂志在线发表研究论文“ Pre-configuring chromatin architecture with histone modifications guides hematopoietic stem cell formation in mouse embryos ”，从跨尺度的染色质三维结构、组蛋白修饰及造血相关转录因子RUNX1的表观调控维度，揭示了HSC起源的命运决定机制。
为了探究哺乳动物胚胎中多维表观遗传层级如何调控HSC发生这一科学问题，该研究突破了少量细胞检测的技术瓶颈，应用少量细胞sisHi-C（small-scale in situ Hi-C）技术3和何爱彬团队于2019年开发的少量细胞itChIP-seq（indexing and tagmentation-based chromatin immunoprecipitation sequencing）技术4，分别在数百个细胞中，检测染色质互作结构、组蛋白修饰及转录因子结合图谱。作者从小鼠胚胎的主动脉-性腺-中肾区和胎肝中分别收集了HSC发育路径上相邻的四种细胞类型：eAEC、HEC、pre-HSC以及LT-HSC（图1）。结合团队近期发表的单细胞转录组数据1, 2，以大范围到小范围的不同层级染色质空间结构发育变化为主线，进行HSC起源的多维表观遗传调控机制解析。
图1.细胞样品示意图及多维表观调控检测
促进造血发生的染色质互作变化发生在拓扑结构域（topologically associated domain, TAD）内部。在大尺度的染色质区室层级（100 Mbp），基因组被划分为转录活跃性高的A类区室和转录活跃性低的B类区室。仅有约10.78%的基因组区域存在任两个时期之间的A/B类区室互换的现象。TAD为染色质区室的下一级结构，其边界富集了H3K4me3信号，存在阻隔强度的动态变化，但并未直接影响TAD边界附近基因的表达。而进一步探究发现，TAD内部的调控元件互作及伴随的组蛋白修饰变化，直接与造血发育进程相关。
HSC特异的增强子在eAEC中已经处于一定程度的激活状态。与以往的从无到有的增强子激活认知不同的是，在EHT初期的eAEC中，造血过程相关TAD中的增强子已经显著富集激活性组蛋白修饰（H3K27ac和H3K4me1）。从eAEC经过HEC，到pre-HSC，增强子的活性信号并没有变化，仅在pre-HSC至LT-HSC这一阶段才进一步增强。这提示在eAEC中，已经初步准备好了造血发生的相关染色质修饰基础，但需要染色质互作结构及转录因子的结合，驱动促进HSC产生（图2）。
染色质互作在早期变化最显著。EHT初期（eAEC-HEC），TAD内部染色质互作大幅度变化，造血相关基因所在区域的互作显著增强。在EHT末期pre-HSC到LT-HSC转变中，TAD内互作只是小幅度增强，但标记活性增强子的组蛋白修饰H3K27ac则一定程度显著提升。整个过程中，相应的抑制性组蛋白修饰H3K27me3逐步减弱，为造血发生创造活跃染色质环境（图2）。
图2. HSC发生的多维表观遗传层级调控示意图
令人意外的是发现早在eAEC时期，RUNX1蛋白已富集结合于增强子-启动子（E-P）互作的锚点区域。RUNX1 是一个重要造血发育相关转录因子5，一般认为它为驱动HSC的发生所必须，其表达时间与HSC一致，它的缺失会造成胚胎造血异常或致死6, 7。受限于检测技术对细胞数目的要求，很多已有研究只能使用体外分化样品或细胞系进行RUNX1的ChIP-seq实验8, 9, 10，以探究RUNX1如何调控HSC细胞命运。利用新开发的高灵敏度itChIP-seq技术，该研究以100-500个分选细胞为起始样品，检测了eAEC、HEC、pre-HSC和LT-HSC的RUNX1全基因组结合图谱。研究发现，HSC发生过程中，RUNX1参与了约40.9%的E-P互作。其中，互作强度暂时或持续上升的E-P互作与造血及免疫过程显著相关（图3）。基于RUNX1结合互作的启动子及增强子区域，该研究预测出与RUNX1协同调控染色质互作的其它转录因子，如GFI1b、PU.1、IRF家族蛋白、SMAD家族蛋白等。该预测结果为RUNX1协同其它转录因子共同调控EHT的机制探究提供了指示方向。
图3. RUNX1参与增强子-启动子(E-P)互作及调控相关生物学过程
该研究突破了体内样品细胞数目限制的技术瓶颈，整合了多层级染色质结构、不同组蛋白修饰及转录因子RUNX1的多组学数据，揭示了HSC起源的表观遗传层级调控新机制。
北京大学未来技术学院分子医学研究所博士李晨、军事科学院博士生张广雨为论文共同第一作者。何爱彬教授、刘兵研究员（解放军总医院第五医学中心）、兰雨研究员（暨南大学）为本文共同通讯作者。感谢清华大学颉伟教授对sisHi-C技术的分享。该研究获得了科技部干细胞专项、国家自然科学基金委、青年千人计划、广东省重点研究开发项目、北京大学生命科学联合中心、北京大学高性能计算中心和生命科学学院凤凰平台的大力支持。
北京大学未来技术学院分子医学研究所何爱彬实验室（http://aibinlab.org/）主要开发单细胞/痕量细胞水平的表观遗传学检测技术，以及单细胞实时成像技术，长期诚聘博士后，欢迎发育生物学、表观遗传学、生物信息学、光学等背景的博士加入实验室。
原文链接：https://www.nature.com/articles/s41467-022-28018-z
参考文献：
1 Hou S , et al. Embryonic endothelial evolution towards first hematopoietic stem cells revealed by single-cell transcriptomic and functional analyses. Cell Res 30, 376-392 (2020).
2 Zhou F , et al. Tracing haematopoietic stem cell formation at single-cell resolution. Nature 533, 487-492 (2016).
3 Du Z , et al. Allelic reprogramming of 3D chromatin architecture during early mammalian development. Nature 547, 232-235 (2017).
Ai S , et al. Profiling chromatin states using single-cell itChIP-seq. Nat Cell Biol 21, 1164-1172 (2019).
5 Chen MJ, Yokomizo T, Zeigler BM, Dzierzak E, Speck NA. Runx1 is required for the endothelial to haematopoietic cell transition but not thereafter. Nature 457, 887-891 (2009).
6 Lacaud G , et al. Runx1 is essential for hematopoietic commitment at the hemangioblast stage of development in vitro. Blood 100, 458-466 (2002).
7 Yokomizo T , et al. Runx1 is involved in primitive erythropoiesis in the mouse. Blood 111, 4075-4080 (2008).
8 Wilson NK , et al. Combinatorial transcriptional control in blood stem/progenitor cells: genome-wide analysis of ten major transcriptional regulators. Cell Stem Cell 7, 532-544 (2010).
9 Gilmour J, Assi SA, Noailles L, Lichtinger M, Obier N, Bonifer C. The Co-operation of RUNX1 with LDB1, CDK9 and BRD4 Drives Transcription Factor Complex Relocation During Haematopoietic Specification. Sci Rep 8, 10410 (2018).
10 Nottingham WT , et al. Runx1-mediated hematopoietic stem-cell emergence is controlled by a Gata/Ets/SCL-regulated enhancer. Blood 110, 4188-4197 (2007).