光学显微镜的分辨率受到衍射极限的限制，只能达到 ~ 200 nm的分辨率。在最近二十年中，STED、SIM、PALM/STORM、DNA-PAINT等一系列技术，通过点扩展函数（point spread function, PSF）的调制，突破了光学衍射的限制，使光学分辨率最低达到20nm，得到广泛的生物应用并获得2014年的诺贝尔化学奖。

2017年，诺贝尔奖得主Stefan Hell（STED技术的发明人）发展了MINFLUX技术（MINimal photon FLUXes, 最低光子数显微成像），并将其称为“后诺贝尔奖时代的显微技术”。MINFLUX进一步提升了光学分辨率，可以获得 ~ 1 nm的定位精度和 ~ 5 nm的空间分辨率。MINFLUX作为单分子定位技术，结合了STED与STORM两种技术的特点。与STED的淬灭光使用甜甜圈（donut）形状的中空光斑不同的是，MINFLUX使用donut光斑作为激发光；类似GPS定位的原理，MINFLUX使用甜甜圈光斑对荧光分子进行多次激发，进而可以通过统计学方法，估计出荧光分子的位置。

1 nm的定位精度已经与单个分子的大小十分接近。但定位精度不等于光学分辨率，分辨率并没有达到 ~ 1 nm的尺度，仍有提升的空间。是否有新的方法，可以进一步提升光学显微镜的分辨率呢？

北京大学的席鹏实验室从理论上证明了，将双光子激发（two-photon excitation, TPE）用于MINFLUX技术中，可以再将定位精度和分辨率提高2倍，获得小于 1 nm 的定位精度。该结论以 Two-photon MINFLUX with doubled localization precision 为题，发表于最新一期的 eLight  期刊 。文章结果显示，双光子MINFLUX（Two-photon MINFLUX, 2p-MINFLUX）不仅可以提升2倍的定位精度，同时可以具有更为直接的多色成像潜力。

该工作得到了超分辨权威专家Fernando Stefani教授课题组的点评，以 Multiphoton single-molecule localization by sequential excitation with light minima  为题发表于 Light: Science & Applications[https://doi.org/10.1038/s41377-022-00763-2] 。点评指出，该工作为多光子效应引入MINFLUX技术以及为今后MINFLUX应用于深层生物成像和实现更高定位精度提供了前瞻性理论基础。

MINFLUX的技术原理关键在于，donut光斑零点附近的梯度，远高于高斯光（Gaussian beam）顶点附近的梯度。MINFLUX使用donut零点附近进行定位，即可降低定位所需光子数量、提高定位精度。文章指出，由于双光子激发的非线性效应，荧光强度正比于激发光强度的平方，于是donut零点附近的梯度将被进一步提高（图1）。对比2p-MINFLUX和传统MINFLUX，在采集到同样荧光光子数的条件下，2p-MINFLUX理论上可以获得2倍的定位精度提升；若为获得同样定位精度，2p-MINFLUX只需要1/4的光子数即可实现。

图2直观对比和展示了2p-MINFLUX和现有1p-MINFLUX成像过程和结果。一方面，在2p-MINFLUX和1p-MINFLUX采集到同样荧光光子数的条件下，1p-MINFLUX无法分辨的结构，可由2p-MINFLUX分辨（图1b,c）。另一方面，在2p-MINFLUX和1p-MINFLUX达到同样定位精度时，2p-MINFLUX只需要1p-MINFLUX的1/4的光子数（图1c, d）。

图1. 双光子MINFLUX的模拟成像结果。该结果直观体现了2p-MINFLUX “定位精度2倍”和“光子数1/4倍”的关系。

由于双光子非线性效应的存在，2p-MINFLUX将可能具有更为直接的多色成像能力；同时，2p-MINFLUX不仅可以作为超分辨成像手段，也可作为高速多色单分子追踪的方法。该技术可以进一步促进生物医学领域的基础研究，尤其是生物互作方面诸如核酸-蛋白互作、病毒-细胞互作的研究。

本工作的第一作者为北京大学未来技术学院博士生赵堃，赵堃同学也是北京大学-佐治亚理工学院-艾默里大学联合培养博士。合作者为未来技术学院博士生徐鑫舳(也为联合培养博士)、博士生任伟，和南方科技大学金大勇教授。席鹏教授是本工作的通讯作者。本工作得到了北京市科委、深圳市科委、国家自然科学基金委、科技部等的基金资助。

Link: https://elight.springeropen.com/articles/10.1186/s43593-021-00011-x