2023年12月15日，北京大学未来技术学院、生命科学联合中心赵扬研究组在iScience杂志上发表了题为“Robust small molecule-aided cardiac reprogramming systems selective to cardiac fibroblasts”的研究论文，报道了使用小分子组合2C（以SB431542为代表的ALK5抑制剂加上以Baricitinib为代表的泛Jak抑制剂）辅助Gata4，Mef2c和 Tbx5 (GMT)三个基因诱导心脏成纤维细胞重编程成为心肌细胞，可实现成纤维细胞向心肌细胞转分化效率和功能性的大幅提升，并缩短诱导周期1。有趣的是，2C的加入可以减少转录因子Gata4的使用，简化了成纤维细胞向心肌细胞转分化的重编程基因组合。进一步研究者发现，通过MT+2C这一新的重编程因子组合可以实现心脏成纤维细胞特异性的诱导为心肌样细胞，而其它组织器官来源的成纤维表和心脏的其它细胞类型均没有重编程的响应（图1）。这些发现不仅有利于理解细胞命运决定的分子机制，建立了高效的重编程方法；而且为在体原位直接重编程解决细胞靶向性的问题提供了新的思路，有助于原位重编程这一全新心脏再生策略的转化应用。

图1 论文的图片摘要

通过向心脏成纤维细胞中过表达 Gata4，Mef2c和 Tbx5 (GMT) 将其转分化成心 肌细胞样细胞（Induced cardiomyocyte-like cells, iCMs）应用于疾病建模和心脏修复是一种创新性的并且非常具有应用前景的手段2-4。然而，转分化效率问题是进一步应用的主要瓶颈。本研究通过对大约 2000 个化学小分子的大规模初步筛选和进一步的验证与浓度、作用时间以及小分子间的组合等优化，鉴定出一种含有两个化学小分子的组合 （2C）能够非常显著促进由 GMT 介导的小鼠的成纤维细胞向心肌细胞转分化。利用这一体系诱导出生后小鼠的皮肤成纤维细胞为功能性心肌样细胞，可将心肌样细胞报告系统alpha-MHC-mCherry+ 的细胞数量提高35倍，在开始诱导后的2周即可观察到大量能够自发收缩的心肌细胞样细胞。经过新的重编程组合诱导4周，超过60%的细胞能够共表达心肌细胞的特异性的肌节结构蛋白 cTnT和alpha-actinin，并且具有排列整齐的肌节结构。

研究者进一步发现在2C的帮助下即使去掉Gata4仅保留Mef2c + Tbx5 (MT)两个因子就足以在2周内高效地将心脏成纤维细胞诱导成能够自发收缩的功能性心肌细胞。更重要的是，诱导后超过50%的细胞能够自发收缩，具有自发的钙瞬变。作为比较，近期报道的高效的促进成纤维细胞向心肌细胞转分化的小分子组合 (SB431542 + XAV9369) 在相同的诱导时间只能诱导不超过1%的自发跳动的心肌细胞5。此外，绝大多数的2C处理诱导得到的iCMs能够表达心室型心肌细胞特异性的结构蛋白Myl2v，表明诱导得到的iCMs可能主要是心室型心肌细胞。新的重编程因子组合诱导得到的心肌细胞具有与内源心肌细胞类似的表达谱，且转录组整体也更接近于成年的心肌细胞。综上，新的小分子组合2C大幅提升了重编程诱导心肌细胞的效率和细胞质量，减少了重编程基因的使用。

此外，本研究发现的MT + 2C组合可以选择性地将心脏来源的成纤维细胞诱导转分化成心肌细胞样细胞，无论是新生小鼠的心脏成纤维细胞、健康的成年小鼠的心脏成纤维细胞还是成年小鼠心梗手术之后被激活的心脏成纤维细胞都能更为高效地诱导转分化成心肌细胞样细胞；而其它组织器官的成纤维细胞则无法被有效地转分化。经过分析，研究者发现在心脏成纤维细胞中，內源表达的Gata4可以被重编程因子进一步上调表达，甚至达到外源转入Gata4的表达水平；而其它来源的成纤维细胞可能因为没有內源Gata4的表达，也无法实现Gata4表达量的大幅提升和其他心肌细胞命运相关基因的表达提升。敲低表达Gata4严重影响了MT+2C诱导心肌样细胞的效率。这一发现说明利用起始细胞內源表达的转录因子，仅通过调整重编程因子组合，即有希望实现在体原位重编程的细胞靶向性，为重编程策略的转化应用提供了理论基础。

此外，2C还能非常显著地促进人成纤维细胞向心肌细胞的转分化，将cTnT阳性的细胞提高了20倍。而且，2C + 4F (MEF2C, TBX5, MESP1 和 MYOCD) 能选择性地将人心脏成纤维细胞转分化为心肌样细胞，而人皮肤成纤维细胞不能被有效诱导转分化。这一新的重编程因子组合在人类细胞上的作用提示了其未来转化应用的潜力。

在小分子的机制研究上，研究者通过同一靶点的小分子替代和下游基因的敲低/过表达验证了SB431542作为已知的TGF-beta受体ALK5的抑制剂主要是通过抑制TGF-beta信号通路发挥作用。而对于Baricitinib已知的靶点（Jak1、Jak2、Jak3）的敲低并不能有效促进转分化，而Baricitinib的另一已知靶点Tyk2的敲低虽然能在部分心肌标志物的诱导表达上可以促进转分化，但在跳动的心肌样细胞的诱导效果上与Baricitinib相比仍有显著差异，提示Baricitinib发挥作用并非（仅）依赖于对Tyk2的抑制。进一步的数据分析和实验验证表明Baricitinib在抑制Tyk2的同时，还下调了多个基因（Oas2, Oas3, Serpina3n和Tgfbi）的表达以促进成纤维细胞向心肌细胞的转分化。而且，SB431542促进细胞转分化的同时会上调Serpina3n和Tgfbi的表达，Baricitinib则进一步将SB431542上调的Serpina3n和Tgfbi下调，从而体现出SB431542和Baricitinib的协同作用，促进成纤维细胞向心肌细胞的转分化。

北大生命科学联合中心（CLS） 2017级博士研究生陶言梦（已毕业）是本论文的第一作者。北京大学未来技术学院、生命科学联合中心的赵扬研究员是本论文的通讯作者。此外，前沿交叉学院的2018级博士研究生杨洋，分子医学研究所2016级博士研究生杨正浩（已毕业），生命科学学院的博士后王礼鹏对本研究作出了大量贡献。北大生命科学学院王世强教授指导了本研究的心肌样细胞电生理鉴定工作。本研究的顺利开展得到了发育编程和代谢调节国家重点研发计划课题（2018YFA0800504）、国家自然科学基金委优青项目 （31922020）、北京大学-清华大学生命科学联合中心，以及南京景瑞康分子医药科技有限公司、南京昕瑞再生医药科技有限公司的支持。

1. Tao, Y., Yang, Y., Yang, Z., Wang, L., Wang, S.-Q., and Zhao, Y. (2023). Robust small molecule-aided cardiac reprogramming systems selective to cardiac fibroblasts. iScience 26. 10.1016/j.isci.2023.108466.

2. Ieda, M., Fu, J.D., Delgado-Olguin, P., Vedantham, V., Hayashi, Y., Bruneau, B.G., and Srivastava, D. (2010). Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell 142, 375-386. 10.1016/j.cell.2010.07.002.

3. Qian, L., Huang, Y., Spencer, C.I., Foley, A., Vedantham, V., Liu, L., Conway, S.J., Fu, J.D., and Srivastava, D. (2012). In vivo reprogramming of murine cardiac fibroblasts into induced cardiomyocytes. Nature 485, 593-598. 10.1038/nature11044.

4. Song, K., Nam, Y.J., Luo, X., Qi, X., Tan, W., Huang, G.N., Acharya, A., Smith, C.L., Tallquist, M.D., Neilson, E.G., et al. (2012). Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors. Nature 485, 599-604. 10.1038/nature11139.

5. Mohamed, T.M., Stone, N.R., Berry, E.C., Radzinsky, E., Huang, Y., Pratt, K., Ang, Y.S., Yu, P., Wang, H., Tang, S., et al. (2017). Chemical Enhancement of In Vitro and In Vivo Direct Cardiac Reprogramming. Circulation 135, 978-995. 10.1161/CIRCULATIONAHA.116.024692.