作为一类重要代谢物，羧酸代谢物在诸多核心代谢通路中发挥作用，涉及能量代谢、氧化/还原稳态、脂肪酸代谢和氨基酸代谢等。最近的研究揭示了羧酸代谢物在已知和未知的生化途径中扮演着许多新角色，如蛋白质的翻译后羧酸化修饰。因此，高效快速地定量分析羧酸代谢物对于深入理解上述生物学过程具有重要意义。然而，羧酸代谢物的化学特性决定了其不易实现定量质谱分析：它们亲水性极强，在常规的反相色谱柱上不保留；既不易质子化形成正离子，又在负离子模式下质谱响应低；分子量较小，难以产生可解释的子离子碎片。

图1. DQmB-HA方法提高质谱检测羧酸代谢物的灵敏度。

为解决上述问题，陈知行团队与代谢平台从“点击化学”的前沿思路中汲取灵感，建立了一种以重氮化合物DQmB为核心的“双重点击”衍生化方案——DQmB-HA方法（图1）。该方法利用DQmB酯化羧酸代谢物的羧基，降低其亲水性，增加羧酸在反相色谱柱上的保留。同时，由于羧酸负离子的负电荷被DQmB掩盖，羧酸代谢物的质谱检测模式自然而然地从低灵敏度的负离子模式切换到高灵敏度的正离子模式。不仅如此，DQmB的喹啉基在气相中具有较强的质子亲和性，进一步提高了代谢物在正离子模式的质谱响应强度。重要的是，DQmB的定制化结构特别容易在质谱中产生特征质荷比的子离子碎片（如m/z 91的苄基正离子和m/z 142的喹啉基正离子），有助于多重反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）模式下代谢物的定量分析。此外，DQmB-HA方法利用羟胺（hydroxylamine，HA）和酮的缩合反应，兼顾解决了α-酮酸的“拖尾”问题，展现出重氮化合物与其它衍生化试剂联用时的优良兼容性。

随后，研究者将DQmB-HA方法应用于四类定量检测羧酸类代谢物的生物医学研究场景，分别是：1）极少量细胞的羧酸代谢物检测（如1/5/10个小鼠卵细胞）；2）少量细胞的羧酸代谢流检测（如96孔板乳鼠心肌细胞，每孔1105个）；3）小鼠生理和病理状态下血浆羧酸代谢物的动态检测，如正常饮食与高脂喂养小鼠的禁食-再摄食过程与小鼠心肌缺血-复灌过程；4）人类疾病（如线粒体病MELAS）的羧酸类生物标志物的检测（如5 μL外周静脉血浆）。

图2. 极少量卵细胞的羧酸代谢物检测。

利用DQmB方法可以检测到低至10个小鼠的受精卵细胞中三羧酸循环途径中核心代谢物的变化。相较于未受精的卵细胞，受精卵中苹果酸、富马酸和β-羟基丁酸的水平下降（图2）。检测结果的重现性和稳定性良好。

使用DQmB-HA方法，与正常志愿者相比，线粒体疾病MELAS患者的外周静脉血浆样本中乳酸、苹果酸、丁二酸、富马酸和α-羟基丁酸在MELAS患者的血浆中均有升高（图3b）。根据羧酸代谢物的主成分分析结果，MELAS患者被分为两个代谢亚群，为理解MELAS提供了新的代谢视角（图3c）。上述两类亚群的MELAS患者的病程特征有待继续深入研究。

图3. 临床血样的羧酸代谢物检测。

DQmB-HA衍生化方法基于“双重点击”反应原理，将细胞样品的代谢终止-样品收集-衍生化整合为一步，前处理全流程的总时间控制在30分钟内；羧酸代谢物的检测下限降低至1-10 nM，与经典方法相比灵敏度提升5-2000倍；定量质谱方法的高灵敏度叠加标准化的简便操作，使得DQmB-HA方法有潜力与自动加样装置联用，为生物医学实验室的标准操作提供了极大便利，以实现高通量代谢分析。该衍生化方法已在未来技术学院代谢质谱平台常规使用，期待能够服务更多代谢领域研究。

本研究成果11月9日在线发表于分析化学期刊Analytical Chemistry。北京大学未来技术学院/前沿交叉学科研究院博士生李聪、未来技术学院博士生程昆仑、中国医学科学院药物研究所赵其锦博士为本文的共同第一作者。北京大学未来技术学院陈知行研究员和代谢质谱平台高级工程师权力博士为本文的共同通讯作者。北京大学未来技术学院的金莉老师在小鼠手术、病理中心王雪连工程师在单细胞实验上分别提供了关键技术支持。本研究的生物学实验还得到了北京大学第一医院神经内科王朝霞教授，北京大学未来技术学院陈晓伟教授以及中国医学科学院药物研究所李平平研究员的支持。本研究获得了国家重点研发计划、国家自然科学基金委、北大-清华生命科学联合中心、教育部、北京市卓越青年项目的经费支持。