9月17日，北京大学未来技术学院分子医学研究所陈雷研究组解析了人源sGC全长蛋白与刺激剂YC-1和riociguat以及激活剂cinaciguat复合物的高分辨结构，揭示了小分子药物与sGC相互作用模式，并阐明了药物的激活机制。该文章发表于Nature Communications杂志 (全文链接https://www.nature.com/articles/s41467-021-25617-0)。
一氧化氮（NO）作为一种气体信号分子，在诸多生理过程中发挥重要作用，包括但不限于血管舒张、血小板凝集、神经信号传递和呼吸作用等。NO也是第一个信号通路被完整描述的动物自身合成的气体信号分子1。以心血管系统为例，血液流动产生的剪切力等刺激使得血管内皮细胞内的钙离子浓度升高，从而促进钙调蛋白激活一氧化氮合酶生成NO。随后NO通过自由扩散作用进入邻近的平滑肌细胞，结合并激活胞内的一氧化氮受体——可溶性鸟苷酸环化酶(sGC)，催化GTP环化为cGMP。cGMP作为第二信使，作用于下游多个效应蛋白如PKG来影响诸多生理过程2。在此信号通路中，sGC作为NO受体，对信号的接收和放大具有关键作用，是重要的药物靶点。目前，靶向sGC的药物riociguat（利奥西呱）在临床上用于治疗肺动脉高压3。今年1月，vericiguat（维利西呱）被美国FDA批准用于治疗心衰。
sGC是异源二聚体蛋白，由α和β两个亚基组成，每个亚基包含4个结构域：H-NOX, PAS, CC和催化结构域。2019年陈雷研究组解析了人源sGC全长蛋白在静息状态结构和NO结合的激活状态结构4。这些结构显示β亚基的H-NOX结构域含有一个可结合NO的亚铁血红素。NO结合会引起H-NOX结构域和整个蛋白分子的构象变化，使得sGC由静息状态转变为高活力激活状态。在病理状态下，亚铁血红素可被氧化成三价铁血红素，导致sGC不能结合NO，并处于低活力状态，阻碍了NO信号的传递。此外，三价铁血红素与sGC的亲和力很弱，易丢失6。sGC的活力降低与很多疾病密切相关。因此提高sGC活力以增强NO下游信号可用来治疗高血压等疾病。目前用于提高sGC活力的小分子药物可分为两类：一类是刺激剂，结合含有亚铁血红素的sGC，与NO协同激活sGC，适用于sGC功能正常但上游NO较少的情况，riociguat和vericiguat均属于此类小分子；另一类是激活剂，可结合含有三价铁血红素或不含血红素的sGC并将其直接激活，适用于氧化导致的sGC功能受损7,8。尽管提高sGC活力的小分子药物有重要的治疗作用，但其如何与sGC相互作用并激活sGC仍不清楚。
在寻找sGC刺激剂的浪潮中，最先发现的小分子是YC-1，它可以称为sGC刺激剂之母，后续发现的很多sGC刺激剂都是在YC-1骨架的基础上进行改进与优化而获得的。其中Bayer公司开发的riociguat由于其高激活能力及良好的药物代谢动力学特性，已脱颖而出，用于临床治疗。陈雷研究组制备了sGC与NO及YC-1或riociguat复合物的冷冻电镜样品，三维重构分辩率分别达到3.9 Å和3.6Å。结构显示：YC-1和riociguat结合位点一致，均位于β H-NOX结构域和 CC结构域之间的缝隙中，这也与二者之间相似的分子结构相吻合。YC-1和riociguat的功能基团均与周围的β1 Y112， Y2, F4，Y83, F77, V39, R40，E370和α1 L425相互作用，但riociguat增加的二氨基嘧啶基团还另外与β1 S81有极性相互作用，末端的甲基氨基甲酸酯部分也与α1 R428距离较近。作者进一步通过一系列的突变实验验证了这些氨基酸对于riociguat功能的重要性。通过将刺激剂和NO共同结合的sGC的结构与NO单独结合的sGC的结构进行比对，作者发现刺激剂的结合推开了αE，Y83的Cα原子移动了1Å，且结合位点的F4、F74的侧链位置也发生变动，使得sGC产生了一个在NO单独激活状态下并不存在的口袋，用于刺激剂结合，这暗示刺激剂的结合是通过诱导-契合的机制进行的。
图1：sGC与NO和riociguat或YC-1复合体的结构
Cinaciguat是sGC的激活剂中的典型代表，可结合并激活三价铁血红素或无血红素的sGC。作者分别用三价铁血红素sGC和无血红素sGC制备了结合cinaciguat的冷冻电镜样品。令人意外的是，两种样品中的sGC颗粒均包含两种状态：与激活状态相似的伸展构象，以及与静息状态相似的弯折构象。这两种构象的电子密度分辩率分别达到3.9 Å和4.1 Å。在这两种构象中，cinaciguat均结合在β H-NOX结构域血红素的结合位点。在弯折构象中，与静息状态sGC的结构(PDB ID: 6JT1)比对，cinaciguat取代血红素使得F4和Y112的侧链位置移动，进而导致αF和βA的微小变动，引起感受器模块的构象变化，此变化经传导器模块传递到催化模块并放大，使得催化模块转动了8.6°，但是此构象中催化模块的GTP结合位点仍未打开，不能结合底物，说明该构象处于无活力状态。在伸展构象中，cinaciguat取代血红素导致的构象变化比弯折构象大得多，使得其最终处于完全伸展状态，与NO激活的sGC结构(PDB ID: 6JT2)对比RMSD仅为0.39Å，且有GTP底物结合，说明其处于高活力的激活状态。
通过进一步的结构比对和突变体活力检测，作者发现在伸展构象的sGC中cinaciguat的结合推动了αF的C端导致了感受器模块的构象变化，经由传导器模块传递到催化模块，激活sGC。而在弯折构象中，cinaciguat推动αF的C端的Y112程度较小，不足以引起激活sGC的构象变化，因此sGC仍然处于弯折的静息状态。
图2：sGC与cinaciguat复合体的结构
该研究揭示了sGC与YC-1类型的刺激剂和cinaciguat类型的激活剂结合并激活sGC的分子基础，为进一步优化和开发激活sGC的小分子药物奠定了基础。此两种类型的小分子均结合在非催化结构域，别构激活了sGC，也进一步验证了伸展构象与高活力sGC之间的关联，以及sGC激活过程中由弯折到伸展构象变化的重要性。
图3：刺激剂和激活剂激活sGC模式图
本项研究主要由北京大学未来技术学院分子医学所博士生刘锐和博士后康云路共同完成，陈雷研究员为通讯作者。本工作获得国家自然科学基金委、生命科学联合中心的经费支持。博士后康云路获得了北京大学博雅博士后奖学金的支持。该工作冷冻电镜样品制备、筛选和采集在北京大学冷冻电镜平台和北京大学电镜室完成，得到了李雪梅、郭振玺、邵博、裴霞和王国鹏等人的帮助。该项目的数据处理获得了北京大学CLS计算平台及未名超算平台的硬件和技术支持。
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