2022年7月26日，北京大学未来技术学院赵扬课题组在国际肝脏学期刊《HEPATOLOGY》上在线发表了题为Direct chemical induction of hepatocyte-like cells with capacity for liver repopulation 的研究成果。该研究开发了一种使用化学小分子方法逐级激活内源转录因子从而诱导成纤维细胞向功能性肝实质细胞重编程的体系。经过鉴定，诱导来源的肝细胞不仅与原代肝实质细胞基因表达谱相似，且具有肝细胞的吸收、代谢功能和重要酶活。更重要的是，该细胞具有体内功能，通过细胞移植能在体内重建小鼠的肝脏组织，挽救遗传性肝功能缺陷小鼠的生存率。
如何获取大量功能性肝实质细胞是再生医学领域一个重要而又亟需解决的难题。在以往的研究中，体细胞可以被诱导为多能干细胞后定向分化获得肝实质细胞，使用转基因方法过表达转录因子也可以诱导体细胞向肝实质细胞直接重编程（Direct reprogramming）(P. Huang et al., 2011; Sekiya & Suzuki, 2011)。这些方法大多依赖于转基因操作和病毒载体。近年来，化学小分子也已被用于诱导细胞命运的转化及重编程，例如通过小分子化合物组合将成纤维细胞诱导成为多能干细胞、神经元、星形胶质细胞、棕色脂肪细胞、肌肉细胞等。且这种化学重编程方法具有不破坏基因组、作用可逆、方便微调、以及易于标准化等优点，因此发展前景广阔。通过小分子先将成纤维细胞诱导为内胚层或胚外内胚层样细胞后能够进一步向肝实质细胞分化(Cao et al., 2017; Li et al., 2017)，但迄今为止，还没有纯化学小分子诱导直接重编程的方法可以诱导产生具有体内再生和肝脏重建功能的肝实质细胞。
图1.化学小分子诱导细胞重编程的模式图
在这项研究中，研究者发现在已报道的化学诱导多能干细胞重编程体系的最早阶段，已经激活表达了部分肝实质细胞发育和功能相关的转录因子，如Nr2f1、Hnf1b、Hhex和Onecut1等。通过将这些细胞切换到适合肝实质细胞培养的培养体系，并微调小分子浓度的切换时间，研究者成功开发了直接将小鼠成纤维细胞重编程为有功能的肝实质样细胞（Chemically induced hepatocyte-like cells，CiHeps）的体系。进一步使用RNA测序、肝功能和酶活检测实验对CiHeps进行鉴定，研究者发现CiHeps具有与直接从体内分离获得的原代肝实质细胞具有高度相似的基因表达谱，并在体外功能的测试中展现出与原代肝实质细胞相似的功能，如糖原储存、ICG和LDL的吸收能力等。尤其是在药物代谢方面，CiHeps同时具备细胞色素P450（Cytochrome P450，CYP）和尿苷二磷酸-葡萄糖醛酸基转移酶（UDP-glucuronosyl transferase，UGT）活性。更重要的是，CiHeps还能在小鼠的体内发挥功能，挽救刀豆蛋白A诱导的肝衰竭和死亡，减少肝损伤，以及整合到肝脏原位，重建Fah–/–Rag2–/–Il2rg–/–（FRG）小鼠的肝脏，并降低肝脏的纤维化，改善肝脏功能。这表明CiHeps是一种功能性成熟的肝实质样细胞。
随后，对化学重编程的分子路径的研究发现，肝脏富集转录因子如Foxa1/2/3、Cebpa、Nr1i2、Hnf4a和Nr1h4等的逐级激活介导了CiHeps的诱导。其中Hnf4a的激活是其中最关键的一个步骤，甚至单独过表达这个基因就能够结合其它小分子直接诱导成纤维细胞向肝谱系的重编程。此外，单细胞RNA测序还揭示了这种化学重编程方法的其它副产物，胃肠样细胞和角质上皮样细胞。研究者的进一步分析阐释了成纤维细胞向这些功能性上皮样细胞发生命运转变的调控过程，以及向各个细胞谱系发展的关键调控因子（图1）。
综上，该研究通过使用化学小分子激活肝富集因子的逐级启动，实现了成纤维细胞的直接重编程，获得了功能成熟的肝实质样细胞。通过研究这种化学诱导的肝谱系重编程方法的分子路径和调控过程，提供了一种开发化学诱导直接重编程方法的系统性思路和肝实质细胞命运建立的分子路径，这种方法有希望进一步拓展到人类细胞中，满足再生医疗领域治疗急、慢性肝衰竭对于大量肝脏实质细胞来源的需求。
图2. 化学激活多谱系预设状态促进化学诱导功能性细胞重编程过程的概念图
此外，化学诱导多能干细胞重编程体系的最早阶段被激活除了与肝脏谱系相关的转录因子，也包括生物发育早期其他器官的一系列重要的转录因子。赵扬实验室前期和北京大学汤超实验室、中科院动物所郭帆实验室合作曾揭示了这种多谱系转录因子的激活过程，以及表观遗传状态的开放性，并且利用这个特殊的化学激活多谱系预设状态（Chemically activated multi-lineage priming，CaMP）大大提升了化学诱导神经元和肌肉细胞的直接重编程效率(Yang et al., 2022)。这种通过先诱导成纤维细胞进入多谱系激活状态，再将其特化到特定细胞类型的方法（图2）也将有望拓展到再生医学领域其它有需求的细胞类型（例如心肌细胞、内皮细胞、胰岛beta细胞）上。
北京大学未来技术学院博士研究生白云飞为该论文第一作者，杨正浩博士为第二作者，赵扬研究员为通讯作者。Niels Bohr Institute的徐小婵博士、北京大学未来技术学院生信平台丁晚秋博士和研究生齐俊添为本研究提供了转录组分析，北京药理毒理研究所李广路同学，张文鹏博士与庄笑梅研究员为本研究中所涉及的CYP和UGT酶活检测做出了重要贡献，中科院分子细胞科学卓越创新中心周斌研究员为本研究提供了用于谱系追踪的转基因小鼠。该工作得到国家重点研发计划（2018YFA0800504）和国家自然科学基金（32170743、31771645、31922020）的支持。
原文链接：https://aasldpubs.onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/hep.32686
参考文献：
1. Cao S, Yu S, Chen Y, Wang X, Zhou C, Liu Y, et al. Chemical reprogramming of mouse embryonic and adult fibroblast into endoderm lineage. Journal of Biological Chemistry. 2017;292:19122–19132.
2. Li X, Liu D, Ma Y, Du X, Jing J, Wang L, et al. Direct reprogramming of fibroblasts via a chemically induced XEN-like state. Cell Stem Cell. 2017;21:264–273.
3. Huang P, He Z, Ji S, Sun H, Xiang D, Liu C, et al. Induction of functional hepatocyte-like cells from mouse fibroblasts by defined factors. Nature. 2011;475:386–391.
4. Sekiya S, Suzuki A. Direct conversion of mouse fibroblasts to hepatocyte-like cells by defined factors. Nature. 2011;475:390–395.
5. Yang Z, Xu X, Gu C, Nielsen AV, Chen G, Guo F, et al. Chemical Pretreatment Activated a Plastic State Amenable to Direct Lineage Reprogramming. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 2022;10.