NADPH氧化酶是一类跨膜氧化还原酶，将电子从膜一侧的NADPH跨膜传递给另一侧的氧分子，生成以超氧阴离子和过氧化氢为主的活性氧类物质（ROS）¹。人体内的NADPH氧化酶有7种：NOX1-NOX5、DUOX1、DUOX2 ²，它们参与了多种生物学过程，包括宿主防御、信号转导、激素合成等¹。其中，关于NOX2（也称gp91^phox）的研究最为深入。NOX2主要在吞噬细胞中表达，是吞噬细胞NADPH氧化酶的催化亚基，与p22^phox(p22)亚基形成异源二聚体，共同构成处于静息状态的NOX2-p22复合物³。吞噬细胞的NADPH氧化酶在哺乳动物的先天免疫系统中发挥重要作用，当静息的NOX2-p22复合物被胞内的调节亚基（p47^phox, p67^phox, Rac等）激活时，NOX2便会传递电子产生超氧阴离子，超氧阴离子进一步转变成ROS，这对于杀死入侵的病原微生物起到了重要作用³。NOX2功能缺失性基因突变会导致免疫缺陷疾病——慢性肉芽肿病⁴，该病患者由于先天免疫功能的缺失，非常容易受到细菌或真菌感染，严重时可致命。尽管吞噬细胞的NADPH氧化酶具有重要的生理功能，但由于其结构未知，它工作的分子机制仍不清楚。

2022年11月22日，北京大学未来技术学院分子医学研究所，北大-清华生命科学联合中心陈雷研究组在ELife杂志上发表了题为“Structure of human phagocyte NADPH oxidase in the resting state”的研究论文，该研究通过单颗粒冷冻电镜技术解析了人源吞噬细胞NADPH氧化酶复合体在静息状态下的高分辨结构。链接见：https://elifesciences.org/articles/83743

陈雷研究组在HEK293F细胞中共表达了人源NOX2与C端融合了GFP的人源p22，共表达NOX2和p22的细胞膜能被调节亚基激活，在Amplex red酶活测定体系里产生过氧化氢 （图1）。说明在该表达系统中，NOX2和p22能够正确折叠和组装。作者们纯化了异源表达的NOX2-p22复合物，组装到了纳米磷脂盘（nanodisc）里，并且加入了抗人源NOX2的单抗7D5 Fab片段 ⁵和能够结合7D5 Fab的纳米抗体TP1170⁶来辅助蛋白纯化和冷冻电镜数据计算。体外纯化的NOX2-p22-7D5 Fab-TP1170复合物能被调节亚基激活，说明其具有正常的生物学功能，可进一步用于结构生物学研究。通过单颗粒冷冻电镜技术，作者成功获得了分辨率为2.8 Å的NOX2-p22-7D5 Fab-TP1170复合物的电子密度并搭建了原子模型。

复合物的结构表明，NOX2由N端跨膜区结构域（TMD）和位于胞质的C端脱氢酶结构域（DH）构成，TMD结合一对血红素（outer haem和inner haem），DH的FBD结构域结合一个FAD （图1）。NOX2的TMD由6根跨膜螺旋构成，而p22有4根跨膜螺旋。其中，NOX2跨膜螺旋M3,M4,M5和p22跨膜螺旋M1,M4参与NOX2-p22异源二聚体的组装。7D5 Fab与NOX2胞外loop C和loop E结合。在电子密度图中，还观察到了很多磷脂样的密度。

图1：人源NOX2-p22复合物静息状态结构

将静息状态的NOX2-p22复合物结构与激活状态的DUOX1⁷结构进行比较,作者们发现与激活状态的DUOX1相比，静息状态NOX2-p22的DH结构域转动了49.4°，上移了2.3 Å；FAD移动了12.4 Å（图2）。FAD与inner haem的距离（6.1 Å）远大于激活状态DUOX1的FAD与inner haem的距离（3.9 Å），可能难以将电子从FAD高效传递到inner haem。此外，尽管在制样时加入了过量NADPH，作者们并没有观察到底物NADPH的密度，说明静息状态下NADPH与NOX2的亲和力低。在DUOX1结构中^7,8,NADPH同时结合TMD和DH的氨基酸；而静息状态NOX2的DH的位置使NADPH不能同时结合TMD和DH，这可能是导致NADPH亲和力低的原因。静息状态下NOX2的DH所在位置使得它不能很好地将电子从FAD传递到inner haem。作者们推测当NOX2被胞质内的调节亚基激活时，DH会被稳定在类似于激活状态的DUOX1所在的构象，从而使NADPH的亲和力增加，使电子从FAD到inner haem的传递效率提高（图3）。

图2：静息状态NOX2与激活状态DUOX1结构比较

图3：NOX2激活机制模式图

综上所述，本项研究解析了人源NOX2-p22复合物在静息状态下的高分辨结构，揭示了该异源二聚体的组装机制，同时也为解释NOX2的激活机制提供了重要参考。值得一提的是，Genentech公司于今年10月在Nature Communications杂志上发表了人源NOX2-p22 核心部分3.2Å的结构，链接见(https://www.nature.com/articles/s41467-022-33711-0)。本项研究与Genentech研究组获得的NOX2-p22核心部分结构基本一致，但Genentech研究组报道的结构中DH结构域电子密度完全不可见，其蛋白样品也没有活力，这可能是由于其样品处于去垢剂中而没有磷脂双分子层环境造成的。

本项研究主要由北京大学未来技术学院分子医学研究所博士研究生刘锐和宋康成完成，博士后吴惊香在课题开展的前期提供了重要支持，研究生耿小鹏在毕业设计期间参与了部分工作，陈雷研究员为通讯作者。北京大学化学与分子工程学院的彭海琳教授及研究生郑黎明和高啸寅提供了石墨烯载网用于样品制备。陈雷研究组的刘啸宇和时亦廷在文章写作和作图过程中提供了重要帮助。该工作冷冻电镜样品制备、筛选和采集在北京大学冷冻电镜平台完成，得到了李雪梅、郭振玺、秦昌东、裴霞、惠小娟和王国鹏等人的帮助。该项目的数据处理得到了北京大学CLS计算平台及未名超算平台的硬件和技术支持。该课题得到科技部和国家自然科学基金等经费支持。

1 Lambeth, J. D. & Neish, A. S. Nox enzymes and new thinking on reactive oxygen: a double-edged sword revisited.

2 Bedard, K. & Krause, K. H. The NOX family of ROS-generating NADPH oxidases: physiology and pathophysiology.

3 Winterbourn, C. C., Kettle, A. J. & Hampton, M. B. Reactive Oxygen Species and Neutrophil Function.

4 Heyworth, P. G., Cross Ar Fau - Curnutte, J. T. & Curnutte, J. T. Chronic granulomatous disease.

5 Yamauchi, A. et al. Location of the epitope for 7D5, a monoclonal antibody raised against human flavocytochrome b558, to the extracellular peptide portion of primate gp91phox.

6 Pleiner, T., Bates, M. & Gorlich, D. A toolbox of anti-mouse and anti-rabbit IgG secondary nanobodies.  J Cell Biol 217, 1143-1154, doi:10.1083/jcb.201709115 (2018).

7 Wu, J. X., Liu, R., Song, K. & Chen, L. A.-O. Structures of human dual oxidase 1 complex in low-calcium and high-calcium states.

8 Sun, J. A.-O. Structures of mouse DUOX1-DUOXA1 provide mechanistic insights into enzyme activation and regulation.