胰岛是机体糖脂代谢调控的重要组织，由胰岛a、β、δ等细胞组成。胰岛功能障碍导致的胰岛素分泌异常是2型糖尿病发生发展的核心驱动因素。20世纪60年代末，人们就通过开发放免技术测定血浆胰岛素浓度发现，当血糖急剧上升时可以刺激胰岛素快速短暂的第一相分泌和缓慢持续的第二相分泌。2型糖尿病初期，胰岛素第一相分泌降低是b细胞功能受损的标志（PMID:11484070）。虽然经过70年的发展，以分子生物学、电生理学和生物化学等技术手段为核心的还原主义通过研究单基因、单细胞，揭示了胰岛素分泌调控的基本机制。但是2型糖尿病是多因素诱发的复杂疾病，很难找出单个基因作为2型糖尿病第一相分泌缺失的罪魁祸首，因此人们仍不清楚糖尿病相关的胰岛素两相分泌异常如何发生。

2024年1月26日，北京大学未来技术学院分子医学研究所、北大—清华生命科学联合中心陈良怡课题组在NatureMetabolism杂志在线发表题为“Releasable βcells with tight Ca2+-exocytosis coupling dictate biphasic glucose-stimulated insulin secretion”的论文。他们通过开发高时空分辨率的活体胰岛组织荧光成像技术，在胰岛内发现了一群功能性b细胞，称为可释放b细胞（Readily releasable b cells，RRbs）。它们主导了葡萄糖刺激的胰岛素两相分泌，通过同步化分泌形成第一相，持续分泌形成第二相。胰岛β细胞的这种分泌能力的差异主要由Ca2+—分泌偶联效率决定，受到胰岛α细胞、δ细胞的共同调控。RRbs细胞功能紊乱是糖尿病发生发展的重要因素。

21世纪头十年，基于单细胞的膜电容、电镜囊泡图像和整体动物水平的分子敲除实验，人们广泛认为β细胞内存在不同的胰岛素囊泡库，可释放囊泡库（Readilyreleasablepool，RRP）和存储囊泡库（Reservepool，RP），分别参与快速和慢速的胰岛素分泌（PMID:11390882）。然而，这个以单细胞囊泡为核心的机制假说忽略了胰岛b细胞的功能差异（PMID:29559510），以及其他内分泌细胞（如α和δ细胞）的调控作用（PMID: 32694675）。陈良怡教授课题组长期从事跨尺度高时空分辨率荧光成像技术开发，探究糖尿病进程中胰岛素分泌异常的机制。他们利用Zn2+与胰岛素共释放的特性，采用锌离子荧光染料选择性标记胰岛素融合囊泡，结合高速转盘共聚焦显微镜，发明可同时检测胰岛内不同β细胞胰岛素囊泡分泌的方法—“锌闪烁”。利用“锌闪烁”技术，在单个胰岛上同时监测不同β细胞的分泌能力，通过分析这些几百上千个胰岛素囊泡分泌事件的时空分布，他们发现葡萄糖刺激下只有少部分胰岛β细胞分泌胰岛素，大部分β细胞分泌很少（图1）。

图1.葡萄糖刺激胰岛中异质性的胰岛素分泌。a, 18.2 mM葡萄糖刺激前后胰岛素囊泡分泌事件的时空分布图。点的位置显示分泌发生的地点，颜色代表时间。b,分泌事件在三维空间中的分布。c, 胰岛素囊泡动态分泌过程。d, 分泌事件的等高线密度图。e, 单个胰岛细胞的分泌过程。一行代表一个细胞，一个像素代表10s内分泌的囊泡个数。f, 图a中选定的六个细胞分泌动态的详图。标尺为10微米。

通过基尼系数定量评估这种异质性，证明大约40%的胰岛细胞贡献整个胰岛80%的分泌事件。因此，作者将这群分泌能力较强的b细胞定义为RRβs，其余不响应葡萄糖刺激分泌胰岛素的β细胞定义为Releasable-incompetent β cells (RIβs)。对同一个胰岛进行重复葡萄糖刺激，RRβs细胞重叠率高达83%，表明它们是胰岛中稳定存在的功能性β细胞。葡萄糖刺激的胰岛素两相分泌都由这群RRβs所决定，它们通过起始阶段的同步化分泌形成快速第一相，随后的持续异步性分泌产生慢速第二相。

应用b细胞特异性表达Ca2+指示剂的小鼠模型Ins1-GCaMP6f小鼠和新型高性能锌离子探针PKZnR-1（PMID:34423531，未来技术学院陈知行团队合成），作者发现与分泌能力的显著差异相比，全胰岛β细胞的Ca2+信号并没有明显区别。取而代之，RRβs比RIβs具有更强的Ca2+-分泌偶联效率。这与近期报道的基于Ca2+信号特征分类的“高功能”b细胞亚群如Hub/Leadercells（PMID: 27452146；PMID: 32694805），1strespondercells（PMID: 36099294）等明显不同，说明Ca2+信号并不能够指代胰岛β细胞的功能。随后作者也进一步证明β细胞的分泌能力差异，是邻近的a细胞通过GLP-1受体和Glucagon受体促进胰岛素分泌，和d细胞通过Somatostatin抑制胰岛素分泌共同作用的结果。

最后，作者在瘦素缺失的ob/ob小鼠胰岛上发现，其RRβs数目显著减少（4周龄50% vs 30%，8周龄42% vs 27%，图2a-2b）。而且ob/ob小鼠b细胞Ca2+信号也从正常小鼠的Constant模式转变为Spike模式, 导致RRβs以“Burst”的形式来分泌胰岛素（图2c-2d）。这些现象表明在胰岛水平，RRβs是胰岛素两相分泌调控的核心，RRβs功能失调是胰岛功能紊乱的关键环节。

图2.ob/ob小鼠胰岛的异常胰岛素分泌。a,成年ob/ob小鼠及其同窝杂合子胰岛的胰岛素囊泡分泌时空分布。b, RRβs细胞在胰岛细胞中的比例。c, ob/ob小鼠及其同窝杂合子胰岛中RRβs细胞的钙信号（曲线）与胰岛素囊泡分泌事件（柱状图）的关系。d,不同钙信号触发的分泌事件比例。

综上，本研究通过开发跨尺度的高时空分辨率的胰岛组织成像技术，鉴定了胰岛中的功能性β细胞，RRβs细胞。揭示了七十年来人们一直争议的胰岛素两相分泌机制：是RRβs细胞而不是每个胰岛b细胞中的囊泡库决定了葡萄糖刺激的胰岛素两相分泌。本研究也表明基于还原论的研究思想，不能完全阐明生命活动的调控机制。单个b细胞组织成一个完整胰岛时其个体的功能受到限制。它们通过某种超越其基本组成单位的集体主义行为，会涌现出新的特性。这种特性不可能被细胞水平上、分子操纵的实验所完全阐明清楚。因此，结合不同尺度上研究、发展在不同尺度上的高分辨率功能成像方法往往是找到生理和病理关键机制的必经之路。

该工作在线发表的同时，Nature Metabolism以Research Briefing的形式介绍了该工作（“Functionally heterogeneous β cells regulate biphasic insulin secretion”）。课题组还在Nature research communities发表了作者们跨越13年的背后故事“From a new method to a new mechanism: the Long March to understand how islet insulin secretion is regulated by glucose stimulation”。

北京大学陈良怡教授和广州国家实验室刘会生研究员为本文共同通讯作者。北京大学彭晓红（原博士后，现为主管技师）、任会霞（博士后）、杨璐（助理研究员）、佟诗妍（毕业博士生）为本文共同第一作者。北京大学汤超院士、广州国家实验室徐涛院士、北京大学陈知行教授、西湖大学章永登教授为本研究提供了重要支持和帮助。本研究得到了国家杰出青年基金、国家重点研发计划基金和新基石科学基金等基金项目的支持。

原文链接：https://www.nature.com/articles/s42255-023-00962-0

Research Briefing链接：https://www.nature.com/articles/s42255-023-00964-y

Behindthestory链接：https://communities.springernature.com/posts/from-a-new-method-to-a-new-mechanism-the-long-march-to-understand-how-islet-insulin-secretion-is-regulated-by-glucose-stimulation