北京大学未来技术学院席鹏课题组与合作者在活细胞超分辨成像领域取得新突破，翻开了活细胞线粒体STED（Stimulated Emission DepletionMicroscopy）长时程观察的新篇章。该工作开发了一种新型线粒体染料MitoESq-635，其饱和光强相较于传统的ATTO 647N降低3.4倍，有利于长时间STED超分辨成像。利用这一优势，该工作实现了对活细胞线粒体长达50分钟的活细胞动态观测，达到了35.2纳米的超高分辨率，观测到了线粒体聚合以及分裂的动态过程。该成果于7月24日在线发表在《自然·通讯》（Nature Communications）上。

线粒体是细胞的“发电厂”，其内部具有丰富的线粒体嵴用于ATP合成。由于它具有自己独立的DNA，其也经常被认为是远古细菌入侵细胞并形成共生关系的一种典范。同时，在癌症等疾病中，由于新陈代谢异常，线粒体嵴也呈现异常。然而，受到衍射极限的影响，传统显微镜只有300nm左右的分辨率，无法观测线粒体嵴这类细微结构。STED超分辨技术因其超高分辨率和较快的成像速度，适用于研究线粒体嵴结构。但是STED技术通常需要较高的光强实现超分辨，对于线粒体的毒性极高，且普通染料很容易被光漂白。该项目所研发的新型线粒体染料MitoESq-635有较低的饱和功率，实现相同的分辨率只需要相对更低的STED光强，降低了光漂白的效果；同时有较高的稳定性，能够长时间照射仍保有较强的荧光强度。共定位结果显示该染料能特异性标记线粒体。这些特性使得它成为活细胞线粒体长时间STED超分辨成像的最佳染料之一。

利用这一染料结合STED超分辨技术，该工作实现了三维切片STED成像，提供了丰富的线粒体三维立体信息。该技术的动态超分辨的观测能力，推动了对线粒体动态过程的定量分析。随着拍摄时间的增加，线粒体的宽度会逐渐变大，荧光强度会缓慢下降，图像分辨率也会下降。团队通过合理地定量分析找到了合适的STED照射光强，平衡了分辨率、信噪比、拍摄时间等几个方面的参数。

该项目清晰地观察到了线粒体聚合以及分离的过程，对比与普通共聚焦显微镜，该技术实现了35.2纳米的超高分辨率，清晰地看到了线粒体嵴的动态变化。同时观察到了线粒体聚合在一起，以及分离开来的动态过程，对线粒体形态学和功能变化的研究有着重要意义。对比电子显微镜的图片，该项目在动态成像的基础上观察到了类似的线粒体结构，也进一步验证了该技术的超高分辨能力。

活细胞线粒体STED长时程成像。（a）线粒体动态成像结果；（b）共聚焦和STED对比；（c）强度分布展现了35.2纳米分辨率

北京大学席鹏教授提到，成像技术的发展目标不外乎“清”“快”“深”“活”（“轻快生活”）四个字，本项目正是在这四字方针的指导下，向“清晰”“快速”“深层”“活体”这四个方面研究突破，实现了35.2纳米的超高空间分辨率，同时可以达到0.66秒每帧的较高时间分辨率，较深的三维切片成像，以及长达50多分钟的活细胞动态成像。

该工作的共同第一作者杨旭三是北京大学工学院毕业博士生（导师席鹏），目前在康奈尔大学进行博士后研究；共同第一作者杨志刚是深圳大学光电工程学院教授，共同一作吴朝阳是北京大学工学院博士生（导师席鹏）。共同通讯作者分别为：席鹏，屈军乐（深圳大学），杨志刚（深圳大学，共同一作），杨旭三（共同一作）。

席鹏课题组近年来致力于超分辨技术的开发与应用，如：1) 综合利用上转换纳米探针的光子雪崩和交叉驰豫特性，实现了上转换低功率STED，将饱和光强降低两个数量级以上(Nature 2017)；2) 利用反射驻波光场调控成功实现19nm的STED超分辨成像，达到目前STED生物样品成像分辨率的最高纪录，并对细胞核孔和病毒丝进行成像(Light 2016)；3) 利用高斯-贝塞尔光场调控，将STED成像的轴向深度提升一个数量级(Laser Photonics Review 2016)；4) 结合偏振与结构光实现荧光偶极子超分辨成像(Light 2016, Nature Communications 2019)，并两次得到Nature Methods的研究亮点评价。这些工作为本工作奠定了坚实基础。

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41467-020-17546-1

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