技术革新是现代生命科学研究的重要引擎，每一次生物技术的迭代与更新，都会给生命科学领域带来颠覆性变化。近年来单细胞测序技术飞速发展，全球科学家进入了揭示生命奥妙的快车道。单细胞表观多组学技术是研究细胞特异性的染色质状态与基因表达调控机制的重要工具。在单细胞水平、无偏地对多维度表观图景进行高精度解析，成为领域内关注的焦点。为了研究复杂生命系统细胞命运的表观调控机制，单细胞多维组蛋白修饰检测技术近两年开始萌芽【1-5】，但现有技术依然存在较大局限性：（1）实验步骤复杂且依赖特殊试剂、仪器，使其很难在一般生物医学实验室推广使用；（2）同时捕获组蛋白修饰数量有限；（3）单细胞数据质量较低且不具备真正意义上的单细胞多维表观与转录组协同分析。因此，亟待开发新型简单易用、超高通量、高质量、高灵敏度的单细胞多维组蛋白修饰检测技术。
2024年1月3日，北京大学未来技术学院、北京大学-清华大学生命科学联合中心何爱彬团队于Science Advances期刊发表了题为“ Single-cell joint profiling of multiple epigenetic proteins and gene transcription”的文章，报道了一种名为uCoTarget（ultra-high throughput Combined TAgmenting enRichment for multiple epiGEneTic proteins in the same cells）的单细胞多维表观检测新技术，能够在单个细胞同时捕获高达5种不同的蛋白质-染色质互作信息。研究者在此基础上进一步优化革新，发展了uCoTargetX技术，在国际上率先实现单细胞多种组蛋白修饰和转录组的并行检测，为深入研究各种生理病理状态下细胞命运的表观调控提供了强有力的技术工具。
何爱彬团队前期已经积累了丰富的单细胞表观多组学技术开发经验【6-8】。针对上述技术瓶颈，研究者优化实验体系，采取逐步添加带有特定标签的抗体-PAT-T7复合物的方案，规避了其他技术中共价交联和纯化的繁琐步骤，并且不依赖物种特异的一抗和特殊的微流控设备，极大提升了uCoTarget技术的简易性和可推广性（图1）。研究者首先在K562和Kasumi-1细胞系中同时对多达5种激活或抑制性组蛋白修饰（H3K27ac、H3K4me3、H3K4me1、H3K36me3和H3K27me3）进行检测，证明了uCoTarget实验的真实性、可靠性和稳定性。为了揭示转录因子和组蛋白修饰在造血干祖细胞产生过程中细胞命运决定的协同或异步作用，研究者结合体外分化模型，利用uCoTarget同时捕获RUNX1、标记活性增强子的组蛋白修饰H3K27ac以及抑制性组蛋白修饰H3K27me3。RUNX1-H3K27ac染色质速率（chromatin velocity）和轨迹分析，能在一定程度上预测心脏和造血谱系的分化路径，并提示RUNX1可能先于H3K27ac发挥驱动作用。进一步，研究人员巧妙地将uCoTarget与基于组合标签的转录组捕获技术相结合，开发出uCoTargetX，率先实现单细胞全基因组范围内多种蛋白-染色质的相互作用和mRNA同时捕获。同一细胞内多维度多种类的分子信息，可以真实准确地反映多维组蛋白修饰模式如何协同或拮抗调控基因表达，有助于我们全面理解生命发育及基因表达调控的多样性和复杂性。
图1 超高通量单细胞表观多组学技术uCoTarget流程图
北京大学未来技术学院已毕业博士王千昊与中国医学科学院血液学研究所熊海清研究员为论文共同第一作者。何爱彬教授和熊海清研究员为本文的共同通讯作者。该研究获得了科技部干细胞专项、国家自然科学基金委和生命科学联合中心的支持。
全文链接：https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.adi3664
附：不同单细胞多组蛋白修饰技术特点比较
uCoTargetX (Xiong et al.) |
multi-CUT&Tag (Gopalan et al.) |
NTT-seq (Stuart et al.) |
Nano-CT (Bartosovic et al.) |
MulTI-Tag (Meers et al.) |
MabID (Lochs et al.) |
|
技术原理 |
抗体和PAT简单孵育后的复合物依次切割逆转录-链置换之后的细胞。共通过4轮组合标签区分单细胞。 |
不同抗体与装配有不同barcodes的PAT预先孵育形成复合物并纯化，同时加入体系靶向切割，通过10x微流控平台区分单细胞。 |
特异亲和不同种属（小鼠或兔）或相同种属不同亚型（IgG1或IgG2a）的nanobody-Tn5可被不同的抗体招募到染色质不同的位置靶向切割。通过10x微流控平台区分单细胞。 |
种属特异性（小鼠或兔）的nanobody-Tn5可分别被小鼠与兔来源的抗体招募到染色质不同的位置进行靶向切割。通过10x微流控平台区分单细胞。 |
偶联有不同T5 barcodes的抗体与protein A-Tn5孵育成复合物，依次加入体系靶向切割。随后二抗与PAT-T7加入体系靶向切割。单细胞通过ICELL8分选到微孔板中进行建库。 |
不同抗体与带有不同barcodes的dsDNA偶联。被Ndel酶切的dsDNA可原位就近连接到被MseI切割的基因组上。分选单细胞至384孔板进行建库。 |
基因组切割和标记策略 |
基于PAT靶向切割（Tagmentation） |
基于PAT靶向切割（Tagmentation） |
基于nanobody-Tn5靶向切割（Tagmentation） |
基于nanobody-Tn5靶向切割（Tagmentation） |
基于PAT靶向切割（Tagmentation） |
基于酶切消化和连接（Tagmentation-free） |
并行检测组蛋白修饰数量 |
>3 |
2 |
3 |
3 |
3 |
>3 |
是否用于检测转录因子结合 |
是 |
否 |
否 |
否 |
否 |
是 |
是否可以并行检测转录组 |
是 |
否 |
否 |
否 |
否 |
否 |
细胞通量 |
超高 （基于多轮组合标签） |
高 （基于微流控） |
高 （基于微流控） |
高 （基于微流控） |
高 （基于微流控） |
低 （基于孔板） |
可能的复杂步骤或注意事项 |
无特定复杂操作 |
需要利用PAT上所带的his-tag纯化富集抗体-PAT复合物 |
需要种属特异的nanobody-Tn5 |
需要种属特异的nanobody-Tn5 |
需要将抗体-adaptor共价偶联 |
需要将抗体-adaptor共价偶联 |
实验仪器平台 |
不需要特殊仪器设备 |
微流控单细胞样品制备仪（10x Genomics Chromium platform） |
微流控单细胞样品制备仪（10x Genomics Chromium platform） |
微流控单细胞样品制备仪（10x Genomics Chromium platform） |
微流控单细胞样品制备仪（10x Genomics Chromium platform） |
不需要特殊仪器设备 |
参考文献：
1. Gopalan S, Wang Y, Harper N W, et al. Simultaneous profiling of multiple chromatin proteins in the same cells. Molecular cell, 2021, 81(22): 4736-4746. e5.
2. Stuart T, Hao S, Zhang B, et al. Nanobody-tethered transposition enables multifactorial chromatin profiling at single-cell resolution. Nature Biotechnology, 2023, 41(6): 806-812.
3. Bartosovic M, Castelo-Branco G. Multimodal chromatin profiling using nanobody-based single-cell CUT&Tag. Nature Biotechnology, 2023, 41(6): 794-805.
4. Meers M P, Llagas G, Janssens D H, et al. Multifactorial profiling of epigenetic landscapes at single-cell resolution using MulTI-Tag. Nature Biotechnology, 2023, 41(5): 708-716.
5. Lochs S J A, van der Weide R H, de Luca K L, et al. Combinatorial single-cell profiling of major chromatin types with MAbID. Nature Methods, 2023: 1-11.
6. Wang Q, Xiong H, Ai S, et al. CoBATCH for high-throughput single-cell epigenomic profiling. Molecular cell, 2019, 76(1): 206-216. e7.
7. Ai S, Xiong H, Li C C, et al. Profiling chromatin states using single-cell itChIP-seq. Nature Cell Biology, 2019, 21(9): 1164-1172.
8. Xiong H, Luo Y, Wang Q, et al. Single-cell joint detection of chromatin occupancy and transcriptome enables higher-dimensional epigenomic reconstructions. Nature Methods, 2021, 18(6): 652-660.